reklama




naši partneři
 
reklama


Nové směry v terapeutickém využití exogenních proteáz?
MUDr. Marta Honzíková  
SANQUIS č.40/2005, str. 30


V posledních letech je v odborném písemnictví věnována zvýšená pozornost tzv. konečným produktům pokročilé glykace (advanced glycation end products, AGEs).

K akumulaci AGEs ve tkáních dochází běžně v procesu stárnutí, ve zvýšené míře je nalézána u pacientů s diabetem a selháním ledvin. Přibývá důkazů pro významnou roli AGEs i v patogeneze dalších závažných chorob.
AGEs vznikají neenzymatickou reakcí ketonové nebo aldehydové skupiny cukrů s volnými aminoskupinami proteinů, lipidů nebo aminokyselin (Mailardova reakce). Z velkého počtu AGEs byl zatím jenom malý počet charakterizován chemicky a identifikován ve tkáních. K nejvíce prozkoumaným patří karboxymethyllysin (CML).
AGEs indukují chemickou modifikaci proteinů a lipidů. Ta je podkladem změn strukturálních a funkčních vlastností proteinů plasmy a extracelulární matrix. Dochází například ke vzniku síťovité struktury proteinů (cross-linking) a ke ztluštění basálních membrán. Následkem vzniku síťovité struktury proteinů je jejich snížená citlivost k enzymatické proteolytické degradaci, na které se podílejí metalloproteinázy. Výsledkem AGEs indukované modifikace lipoproteinů (apoprotein-B, LDL) je jejich zpožděná clearance prostřednictvím normálního LDL receptoru. Interakce AGEs s jejich receptory (RAGEs) a/nebo vazebnými proteiny na povrchu buněk může indukovat buněčnou aktivaci, zvýšenou tvorbu kyslíkových radikálů s následnou aktivací nukleárního faktoru KB (NF-KB) a zvýšenou syntézou cytokinů, růstových faktorů a adhezních molekul. Stejně tak může být vyvolána buněčná proliferace nebo programovaná smrt buňky v závislosti na tom, s jakým buněčným typem AGEs reagují. Těmito účinky AGEs je vysvětlována jejich účast na patogeneze závažných vaskulárních komplikací diabetu (nefropatie, retinopatie, neuropatie a aterosklerózy) a renálního selhání stejně jako některých neurodegenerativních onemocnění (Alzheimerova choroba). Velmi dobře jsou také charakterizovány účinky AGEs na funkci endotelu. V experimentech in vitro i in vivo AGEs „hasí“ efekt kysličníku dusnatého a tak dochází k nedokonalé vasodilataci. Zvyšuje se transendoteliální chemotaxe monocytů a sekrece PDGF (platelet derived growth factor), stejně jako exprese některých adhezních molekul VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) a ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1). Kombinace glykace extracelulární matrix a zánětlivých podnětů umocňuje proces endoteliální adheze.
AGE receptory jsou na povrchu mnoha typů buněk (endotelie, mesangiální buňky, monocyty, makrofágy, neurony). Nejlépe charakterizovaným receptorem pro AGE je RAGE jeden z členů imunoglobulinové nadrodiny.
Úlohou AGEs v patogeneze renálních chorob a diabetické nefropatie se v řadě prací zabývala výzkumná skupina profesora Heidlanda z univerzity ve Würzburgu. Ve svých experimentech mj. řeší i možnost využití některých látek a přípravků k omezení škodlivého efektu AGEs.
Na kultuře epitelových buněk linie LLC-PK1 z prasečích ledvin, které vykazují vlastnosti buněk proximálních tubulů, byl zkoumán vliv AGEs vázaných na bovinní sérový albumin (AGE-BSA) na tubulární buňky. Dále bylo ověřováno, zda může být efekt indukovaný AGEs ovlivnitelný trypsinem (serinová proteáza). LLC-PK1 buňky byly v těchto experimentech po 24 hodin vystaveny působení samotného vehikula bez séra (kontrola), AGE-BSA nebo BSA a to buď s trypsinem nebo bez trypsinu. Byl hodnocen počet a velikost buněk, obsah proteinů v buňce, stejně jako syntéza a degradace proteinů.
Po 24 hodinové inkubaci kultury buněk LLC-PK1 s AGE-BSA významně poklesl jejich počet v porovnání s kontrolní kulturou a s buňkami kultivovanými pouze s BSA (P<0,05). Proliferace buněk v kulturách byla hodnocena pomocí měření inkorporace značeného [3H]thymidinu. Ta významně poklesla po inkubaci s AGE-BSA oproti kontrole (P<0,05), zatímco kultivace se samotným BSA byla bez efektu. Snížení inkorporace thymidinu a pokles počtu buněk v kultuře nebyly způsobeny zánikem buněk, protože vylučování trypanové modři a uvolňování LDH se signifikantně nezměnilo.
Dále bylo po kultivaci LLC-PK1 buněk s AGE-BSA prokázáno statisticky významné zvětšení jejich objemu (P<0,05). Tento efekt se nedostavil ani u kontrolní kultury ani u buněk vystavených působení samotného BSA. S nárůstem buněčného objemu bylo spojeno i zvýšení obsahu buněčného proteinu (P<0,05), opět pouze u buněk kultivovaných s AGE-BSA. Množství buněčného proteinu se zvýšilo zejména díky snížené degradaci proteinu. Syntéza buněčného proteinu byla inkubací s AGE-BSA stimulována jenom slabě.
Společná inkubace buněk s AGE-BSA a trypsinem byla spojena s významným zlepšením všech sledovaných parametrů. Trypsin zvýšil inkorporaci značeného thymidinu (P<0,05), zamezil nárůstu buněčného proteinu, zvýšil poměr degradace buněčného proteinu (P<0,05) a zamezil zvýšení proteosyntézy.
V souhrnu lze tedy říci, že AGE-BSA zhoršuje buněčnou proliferaci a obrat bílkovin v kultuře LLC-PK1 buněk s následným nárůstem buněčného proteinu. Protože současná inkubace s trypsinem zamezuje těmto změnám, lze předpokládat interferenci této serinové proteázy s proteiny vážícími AGEs, které se nacházejí na povrchu buněk.
Za významný patogenetický faktor diabetické nefropatie je považován TGF-ß1 (transforming growth factor ß1). Předpokládá se, že nadprodukci TGF-ß1 vyvolává právě působení AGEs. Proto byl v dalším experimentu, kromě výše popisovaných parametrů, hodnocen i vliv kultivace buněk LLC-PK1 s AGE-BSA na expresi mRNK pro TGF-ß1 a vliv na produkci samotného TGF-ß1 proteinu. Antiproliferativní efekt AGE-BSA byl potvrzen stejně jako v předchozím experimentu. Kultivace buněk s AGE-BSA indukovala expresi TGF-ß1 mRNK stejně jako medium s vysokým obsahem glukózy. Signifikantně bylo zvýšeno i celkové množství TGF-ß1 proteinu v supernatantu. Současná inkubace LLC-PK1 buněk s AGE-BSA a trypsinem zamezila vzniku těchto změn. Je velmi pravděpodobné, že tento efekt je způsoben interakcí trypsinu s AGE-vazebnými proteiny. Tuto hypotézu podporuje i snížení intracelulární akumulace AGEs prokázané v tomto experimentu při inkubaci s trypsinem.
Další významné důkazy podporující hypotézu interakce některých proteáz s receptory pro AGEs přinesl experiment téže skupiny, který se zabýval možnou genotoxicitou AGEs. Chronické renální choroby doprovází zvýšené riziko rozvoje nádorových onemocnění. Nicméně mechanismus, který je podkladem tohoto jevu, není jasný. Diskutuje se účast zvýšeného oxidativního stresu a zvýšených hladin různých uremických toxinů. Jedním z možných činitelů by mohly být AGEs, které jsou u těchto pacientů silně zvýšeny. Pro objasnění tohoto předpokladu byla uskutečněna studie, ve které byl zkoumán možný vliv různých AGEs na strukturální integritu DNA na kultuře epitelových buněk linie LLC-PK1 z prasečích ledvin. Pro kvantifikaci poškození DNA sloužila počítačová mikroskopická analýza jednotlivých buněk po elektroforetické separaci jejich jaderné DNA.
Po inkubaci LLC-PK1 buněk s různými AGEs navázanými na bovinní sérový albumin analýza jasně prokázala signifikantní vzestup poškození DNA. V určitém rozmezí byla pozorována závislost genotoxického efektu na dávce AGEs. Její navyšování přes určitou mez však již zvyšování výsledného efektu nevyvolávalo (navození saturační odpovědi). Jako pozitivní kontrola genotoxicity byl použit etylmethansulfonát (EMS), který působí přímo na DNA.
Pokud byly buňky před inkubací s AGE-BSA vystaveny působení trypsinu nebo bromelainu, zabránilo to vzniku poškození DNA. Působení těchto proteáz ale nezabránilo vzniku genotoxických změn po působení EMS. Tyto nálezy jsou v souladu s myšlenkou, že AGE-indukovaná genotoxicita je zprostředkována vazbou na receptor, a že proteázy trypsin a bromelain inaktivují extracelulární doménu tohoto receptoru.
Jak již bylo uvedeno, nejlépe charakterizovaným receptorem pro AGEs je RAGE, člen nadrodiny imunoglobulinů. Vazba AGEs na RAGE spouští zvýšenou intracelulární tvorbu reaktivních kyslíkových radikálů, o kterých je známé, že indukují poškození DNA. Lze tedy vyvodit, že AGEs indukují genotoxicitu v tubulárních buňkách, která se může podílet na zvýšeném výskytu malignit u pokročilých renálních onemocnění.
Tyto výsledky jsou jistě velmi zajímavým stimulem pro další výzkum terapeutických potencí některých živočišných i rostlinných proteáz.
Výzkum zaměřený na hledání látek, které by zabraňovaly vazbě AGEs na jejich receptory a tím omezovaly jejich patologický efekt, s sebou patrně nese perspektivu další možnosti ovlivnění závažných civilizačních chorob, ke kterým nesporně diabetes, renální choroby a ateroskleróza patří. Možnost omezení patogenity AGEs je zajímavá i vzhledem k jejich vztahu k procesu stárnutí.

Připraveno podle:
1. Xiang G, Schinzel R, Simm A, Sebekova K, Heidland A: Advanced glycation end products impair protein turnover in LLC-PK1: Amelioration by trypsin. Kidney International, (2001), Vol 59; (Suppl. 78), S53-57
2. Xiang G, Schinzel R, Simm A, Münch G, Sebekova K, Kasper M, Niwa T, Schmitz Ch, Heidland A: Advanced glycation end products (AGEs)-induced expresion of TGF-ß1 is suppressed by a protease in the tubule cell line LLC-PK1. Nephrology Dialysis Transplantation (2001), 16; 1562-1567
3. Heidland A, Sebekova K, Schinzel R: Advanced glycation end products and the progresive course of renal disease. American Journal of Kidney Disease (2001), Vol 38, (Suppl 1), S100-S106
4. Stopper H, Schnizel R, Sebeková K, Heidland A: Genotoxicity of advanced glycation end products in mammalian cells. Cancer Letters (2003), 190, 115-156

 



obsah čísla 40 ročník 2005





reklama




reklama
poslat e-mailem








ORBIS PICTUS



PORADNA







 
webdesign: Filip Pešek